无需多次动物实验，Nature新技术让KO细胞大有可为

近日，Nature发表了一篇关于基因编辑细胞的论文，研究人员借助CRISPR-Cas技术开发出一种方法，将大大简化和加速实验动物研究：研究人员同时在单个动物的不同细胞内进行不同的基因改造，让每个细胞中只有一个基因被改变，且器官中的不同细胞以不同的方式改变。这使得研究人员能够在一次实验中研究过去需要进行多次动物实验的内容，这一成果可以帮助人们免于组织或发育时间的限制，为研究生物体的健康和病变机制提供了更多可能^[1]。

相较于复杂的基因编辑动物实验，更多人往往会选择基因编辑细胞实验，但目前还是有许多同学会疑惑，基因编辑细胞采用质粒法、病毒法还是RNP法会更合适呢？下面就这3种方法为大家展开分析。

慢病毒法

研究人员通过慢病毒转染的方式进行敲除，提高转染效率的同时，将Cas基因整合到基因组中，通过增加Cas蛋白和sgRNA在细胞内的存留时间来提高细胞敲除效率。但慢病毒感染存在着两个比较关键的问题：

1. 利用慢病毒法转染Cas会在敲除靶基因的同时引入新的基因，且慢病毒转染的外源基因是随机整合，存在影响其他基因表达的风险。

2. CRISPR-Cas编辑过程存在脱靶效应，慢病毒法会持续表达Cas蛋白，长期存在的Cas蛋白会对这种脱靶效应有累积效应，最终影响实验的严谨性。

质粒法

为了降低脱靶效应，采用的策略是减少Cas蛋白与sgRNA复合物在细胞中的存留时间，因此我们还可以采用质粒法进行KO细胞的构建。即通过将Cas和sgRNA表达载体瞬时转染到目的细胞中，从而在细胞内表达Cas蛋白和gRNA，由于质粒整合到基因组的概率极低，随着细胞传代质粒载体的逐渐消失，再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题，即转染效率较低。

RNP法

与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas蛋白是不带电荷的，而sgRNA是带电荷的，因此只有当Cas与sgRNA结合后，才能更高效地将两者转染到细胞中。同时，由于Cas和sgRNA会被降解，Cas-sgRNA复合物在细胞内的存留时间不会很长，因此发生脱靶的概率很低。从国内外文献报道的情况来看，质粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，对于生物技术企业来说，RNP法具有更高的实验效率。

KO细胞株

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基因敲除的sgRNA要如何设计？又要如何检测脱靶？为什么筛选出了很多单克隆杂合子，但无法筛选出纯合子？对于这些问题，做基因编辑细胞系的小伙伴们应该不会感到陌生。这本「基因编辑细胞系常见问题解答」将为你答疑解惑，距你理想的研究目标又近了亿点点！

不光是基因敲除（KO），基因敲入、点突变等细胞构建也在日常的生物医药研究中占有一定比例，如何借助该技术发表高分文章往往是大家关注的焦点。10月10日（今晚）7点，由赛业生物研发总监周顺博士带来的「基因编辑细胞技术及其应用研究」讲座，将带大家共同探讨相关主题内容~
 

参考文献：

[1] Santinha, Antonio J., Klingler, Esther., Klingler, Esther., Kuhn, Maria.,  and Kuhn, Maria.. "Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq." Nature.