细胞复苏操作与注意要点

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Cyagen的细胞产品均用干冰保存运输，收到后请尽快把细胞转移到液氮中保存，并尽快复苏；如果保存在-80℃冰箱，应该注意温度的稳定（否则细胞的活力会受到很大的影响），并尽快复苏。

细胞复苏步骤和注意要点：

1、准备 37°C 水浴和预热到 37°C的完全培养液；准备好一个15ml的离心管，同时加入9ml的完全培养液； 

2、准备好这些后，将细胞从液氮中取出，放入到水浴锅中，同时轻轻摇动，保证细胞能够在3min内完全溶解，同时应该注意不要把冻存管的管口没入水浴中（可能由水引起污染）。

注意要点：溶解的时间过长会影响细胞的活力，导致死细胞多，细胞状态差；如果从液氮中取出，管内有少量液氮要先-80℃放置10-30分钟，使液氮完全挥发再复苏，避免危险。

3、溶解完全的细胞要快速转移到无菌超净台中，用75％酒精棉球擦外表面。用吸管将冻存管中细胞悬液吸到15ml的含有培养液的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫。

注意要点： 细胞吸出后，用培养液再洗2次冻存管，把细胞全部转移，否则会损失细胞。吹匀时如果很多泡沫会影响细胞活力，导致复苏后死细胞偏多。

4、250 g 离心 5 minutes；弃上清液，加入2-3ml预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。

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注意要点：离心的作用是去除细胞冻存液中DMSO对细胞的影响，否则会导致干细胞分化。重悬务必保证所有的细胞均匀分开，否则会导致细胞成团或者细胞还在贴在底部，损失细胞。去除上清时，要小心（特别是使用5-10ml移液管）避免将细胞吸走，导致细胞数损失，操作熟练的人员，可以直接倒去上清。

5、将重悬的细胞接种到T25或者是T75的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，放入37°C 、5% CO₂ 培养箱中。

注意要点：接种到T25可以比较安全的复苏，推荐新手操作。这样必须在24-48小时后传代。摇匀时要左右轻轻摇动，保证所有的细胞能够均匀的分布。

6、第二天进行换液，保证去除死细胞。正常的培养过程是三天进行一次换液，如果细胞长到有80-90％汇合进行传代。

注意事项：第二天换液可以去除死细胞对正常细胞的影响，正常的复苏情况下是会有少量的死细胞。细胞在80-90％汇合必须进行传代，否则会由于接触抑制而导致细胞的状态变差或者是消化后成团。