课程回顾丨CAR结构设计策略及体外抗肿瘤活性评估介绍

7月11日，赛业生物细胞治疗部体外药效项目管理宋子曦主讲「CAR结构设计策略及体外抗肿瘤活性评估介绍」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。

FAQ:

1.靶分子在T细胞表面高表达的情况下开发CAR-T的风险和对应策略？

2.裸鼠可以用于荷瘤并进行CAR-T治疗研究吗？

3.靶向小鼠和人的CAR-T设计区别是？

4.CAR分子设计应该给氨基酸还是核苷酸序列，如何优化？

5.转染NK的慢病毒滴度要求达到多高？

6.CAR分子载体的长度是多少？
 

Q：靶分子在T细胞表面高表达的情况下开发CAR-T的风险和对应策略？

A：如果靶分子在T细胞表面也高表达，开发针对该靶分子的CAR-T细胞可能会导致自杀效应或自我损伤。因此，以下策略可以考虑：

a.选择不同的靶分子：选择肿瘤特异性表达的分子作为靶点。

b.优化CAR设计：使用更精确的抗原识别结构域，减少对正常T细胞的识别。

c.使用双特异性CAR：设计能识别两个不同靶点的CAR，提高特异性，减少对正常细胞的毒性。

d.基因编辑：敲除或调控T细胞表面高表达的靶分子，以避免自杀效应。

Q：裸鼠可以用于荷瘤并进行CAR-T治疗研究吗？

A：可以。不过裸鼠（Nude mice）缺乏胸腺，导致T细胞缺陷，但是仍保留部分免疫功能，如B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞），这可能影响研究结果。如果条件允许的情况下更推荐使用赛业生物NKG小鼠，NKG小鼠缺乏T细胞、B细胞和NK细胞，是目前最免疫缺陷的小鼠模型之一，能够更好地接受人类细胞移植。

Q：靶向小鼠和人的CAR-T设计区别是？

A：简单来说，靶向小鼠和人的CAR-T设计的区别主要在于以下几个方面：

a.抗原特异性：由于小鼠和人的基因不同，它们表达的肿瘤抗原也不同。因此，CAR-T细胞设计时，针对小鼠的会使用识别小鼠抗原的特异性抗体片段，而针对人的则会使用识别人类抗原的特异性抗体片段。

b.设计和生产细节：虽然CAR-T设计的基本原理相同，但在具体实现时，如启动子选择、信号传导结构域的优化等方面，可能需要根据目标物种的特性进行调整。

Q：CAR分子设计应该给氨基酸还是核苷酸序列，如何优化？

A ：CAR分子设计提供氨基酸序列或核苷酸序列都可以，我们得到序列后会进行对应物种的密码子优化。

关于CAR结构设计上的优化包括增加细胞内信号序列、调整跨膜区域、选择合适的共刺激因子等等。

Q：转染NK的慢病毒滴度要求达到多高？

A：转染NK细胞的慢病毒滴度要求可以因实验条件和目的而异。一般来说，需要足够高的滴度确保高效率的转染。常见的要求一般在10^8 TU/ml以上。如果提供病毒滴度或MOI仍然得不到较高的准染效率，可以考虑通过转座子载体电转NK进行CAR-NK的制备。

Q：CAR分子载体的长度是多少？

A: CAR分子载体的长度取决于其组成部分。一个典型的CAR分子载体包含以下主要部分：

a.单链抗体片段（scFv）：大约750-800个碱基。

b.铰链区（Hinge region）：大约150-300个碱基。

c.跨膜区（Transmembrane domain）：大约150-300个碱基。

d.共刺激信号域（Co-stimulatory domain）：如CD28或4-1BB，大约200-300个碱基。

e.激活信号域（Signaling domain）：如CD3ζ链，大约150-300个碱基。

总的来说，整个CAR分子的核苷酸序列长度大约在1500-2000个碱基对之间。这是一个概略的估计，具体长度可能会根据不同的设计和优化有所变化。