流式细胞术在CAR-T细胞治疗药物开发中的应用问答集锦

Q:流式细胞术操作的具体过程？

1. 方案设计：包括确定检测标志物，依据检测指标表达特性进行配色；

2. 样本处理：依据样本是细胞还是组织样本确定样本的处理方法；

3. 染色：依据所用抗体的特性和检测指标的特性确定染色顺序和染色条件；

4. 上机检测：进行逻辑设门，对检测指标进行分析。

Q:CAR-T细胞治疗方法需要开展哪些方面的评价？

A:在临床前的研究目标主要是评估CAR-T细胞的有效性和安全性，包括体外药效评价和体内药效评价。体外药效的评价指标主要包括CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞活性、细胞因子分泌和CAR-T细胞增殖等。体内药效主要包括肿瘤生长抑制效果、小鼠生存期延长以及毒副作用评估等。

Q:检测T细胞耗竭用什么标志物？

A:T细胞凋亡和活化都有相应的指标来指示，活化指标通常用CD25和CD69两个指标来检测；耗竭指标包括PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4等，其中PD-1是最常检测的一个指标。

Q:四代释放免疫检查点抑制剂的CAR-T细胞，是否可以用流式来检测？

A:首先CAR分子的阳性率一般就是通过流式法来检测，检测目标通常是CAR分子上所带的标签，如CAR分子有荧光标签EGFP就能通过流式检测EGFP来指示CAR分子的表达。其次分泌的免疫检查点抑制剂也是可以通过流式法来检测，但必须满足一些条件，例如免疫检查点抑制剂上有一些标签例如His标签等，就可以通过透膜流式实验来检测；再例如，如果有检测免疫检查点抑制剂的抗体也可以通过流式透膜实验直接对免疫检查点抑制剂进行检测。

Q:在细胞因子释放检测中，常用哪些方法？

A: 目前检测细胞因子的方法有很多。我们常用的方案包括Elisa和CBA方案。Elisa法通常只能实现样本中单因子的检测，因此对多个因子的检测就需要更多的样本量；CBA法可以实现单次多个样本的检测，对样本的需求量比较少。