上一篇文章带着大家了解了干细胞的起源，从受精卵到桑葚胚(modula)再到囊胚阶段，以及干细胞的特性和分类，还有骨髓间充质干细胞的分离提取方法。

 

那大家知道最容易获取的间充质干细胞组织是什么吗？——没错，它就是脐带。今天带大家一文了解脐带间充质干细胞的来源、优势以及分离培养等知识要点。

 

脐带间充质干细胞来源于脐带组织中的一种基质胶，名为华通氏胶！英国的物理学家和解剖学家托马斯·华通氏（Thomas Wharton 1614-1673）于1656年最先在其书内描述了该组织，故取他的名字命名。脐带的解剖结构为2条脐动脉、1条脐静脉和全程包裹着3条脐带血管的华通氏胶，华通氏胶的重要作用之一是能够保护脐带血管不受外力的机械性压迫或扭曲。华通氏胶外观呈乳白色半透明状，主要成分为透明质酸（hyaluronic acid）和硫酸软骨素（chondroitin sulfate）。

 

因其中含有丰富的间充质干细胞，根据其来源的组织将这种间充质干细胞即命名为脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC）。
 

脐带三维结构

（Stem Cells Translational Medicine 2017;6:1620–1630）

 

 

新生儿出生时的脐带在过去通常被当做废弃物处理，由于脐带组织含有丰富的间充质干细胞，使得脐带组织变废为宝。脐带组织获取容易，无伦理争议，且具有间充质干细胞所有的优点，如自我复制、多向分化、归巢特性、修复能力等，相较成体组织干细胞其他起源更为原始，增殖能力更强，具有更低的免疫原性，具有较强的免疫调节作用，众多优势使其成为了干细胞科研工作者的掌上明珠！

 

UCMSC/GFP镜下图

 

据悉，2022年国内共有17个干细胞类新药获得国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）临床试验默示许可IND，主要用于乙肝病毒肝硬化、冠心病、强直性脊柱炎、烧伤、狼疮肾炎、关节炎等治疗研究。细胞来源以人骨髓、脂肪、脐带组织的MSC为主，其中人脐带间充质干细胞相关研究占据半壁江山，可见潜力无限。

 

 

材料准备

1.样本：采集8小时内的脐带一条，长度≥5cm，保存温度4℃。

2.试剂：OriCell^®人脐带间充质干细胞完全培养基50mL，OriCell^®PBS 100mL。

3.耗材：50mL无菌采集瓶一个，50mL离心管5-10个，10mL移液管4个，T75培养瓶若干个。

 

脐带处理

1.1 无菌打开脐带采集瓶，倒掉保存液。

1.2 用OriCell^®PBS清洗脐带采集瓶中的脐带，两遍。

1.3 用镊子取出脐带，用OriCell^®PBS洗净脐带外周血渍。

1.4 剪掉绑有脐带绑绳的两端，中间段脐带使用有齿镊和止血钳去除脐静脉和脐动脉内的残留血液，再次清洗一次，并将脐带剪成3cm左右长的小段。

1.5 去除脐带的1条脐静脉和2条脐动脉，分离出华通氏胶。
 

注意：

一定要将1条脐静脉和2条脐动脉剔除干净，撕出的华通氏胶尽量不要带有静动脉和羊膜组织，否则容易引入杂细胞，影响UCMSC的后续纯度。

 

静动脉内部和脐带表面残留的血液需要洗干净，同样目的是避免混入过多红细胞在初期吸收过多培养基中营养物质，影响后续UCMSC的生长和增殖。

 

1.6 用弯剪将离心管中华通氏胶剪成2-3mm²大小。

1.7 将华通氏胶转移至50mL离心管中，用电子天平称取1g组织块。

1.8 在组织块中加入10mL OriCell^®人脐带间充质干细胞完全培养基，混匀。

1.9 将其转移到T75培养瓶中，并将组织块均匀铺在T75培养瓶内。

2.0 将培养瓶放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

 

换液及传代培养

换液操作

3.1 完成脐带原代处理后第5天，进行第一次换液。

3.2 尽量在不影响组织块贴壁的情况下，回收培养瓶内的培养液和未贴壁的组织块。

3.3 回收组织块和旧的培养基经过250×g，6min离心后，倒掉上清液。

3.4 重新加入10mL OriCell^®人脐带间充质干细胞完全培养基，重新接种于T75培养瓶。

 

注意：全程都要动作轻柔，尽量不影响贴壁组织块的贴壁。

 

3.5 完成第一次换液后第7天，细胞第二次半换液(可以根据生长情况适当调整)。

3.6 尽量在不影响组织块贴壁的情况下，用10mL移液管回收培养瓶内的半量培养液。

3.7 重新加入5mL OriCell^®人脐带间充质干细胞完全培养基于T75培养瓶中。

3.8 完成第二次换液后每隔3天进行半换液一次，直到细胞可以进行传代。

 

P0→P1的传代培养操作

4.1 确认可以进行细胞传代后，去除漂浮和大块的组织块。合并回收培养瓶内的组织块和细胞培养液。

4.2 经600×g，离心5min，收集上清液。

4.3 培养瓶内的细胞使用OriCell^®PBS涮洗残留的培养基后，T75培养瓶加入3mL OriCell^®0.25%胰蛋白酶，消化贴壁细胞。

4.4 消化完成后按T75培养瓶加入之前收集的上清液5mL终止消化，剩余组织块混合液留离心管中，标记，存4℃冰箱备份，直至细胞完成冻存。

4.5 回收所有细胞悬液加入OriCell^®PBS至45mL后经100μm细胞滤网过滤收集滤液，250×g，6min离心后弃去上清。

4.6 细胞沉淀用30mL OriCell^®PBS重悬，取样300ul左右细胞悬液，计数细胞数量和活率。

4.7 根据接种密度要求，吸取需要的细胞悬液，250×g，6min离心后弃去上清，加入25mL OriCell^®人脐带间充质干细胞完全培养基接种于1个T175培养瓶内。

4.8 将培养瓶放入培养箱中37℃，5%CO₂条件培养。

 

P1后传代的操作

5.1 将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

5.2 吸去培养容器中的培养基。用PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)洗涤细胞2次，注意动作轻柔，清洗全面，吸去PBS。

5.3 加入胰酶(T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL)，迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。

5.4 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。立即加入完全培养基(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)，随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

5.5 使用吸管或移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。

 

注意：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，否则可能损伤和损失细胞。

 

5.6 将细胞悬液转移至离心管中。用PBS(T25培养瓶加入约3mL，T75培养瓶加入约6mL)洗涤容器1次，收集残留细胞。

5.7 收集的所有细胞悬液以250×g，离心4min。

5.8 离心后去除上清。加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。将细胞按(2.5~4)×10⁴个活细胞/cm²接种至适宜的培养容器内。

 

注意:

培养人脐带间充质干细胞对于细胞密度有较高的要求，我们建议有条件且计数效率较高的情况下，进行手工计数，以期获得精准的细胞浓度指导接种；在没有精确计数条件的情况下，按照适宜比例传代是更好的方法。

通常人脐带间充质干细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。请根据细胞实际生长情况调整传代比例。

 

5.9 摇匀细胞，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中。

5.10 传代次日，观察细胞状态。若发现较多漂浮细胞，应予以换液。待细胞生长至90%汇合，即需传代或冻存。

 

注意：正常情况下人脐带间充质干细胞每代生长时间不超过72h，中途不需要换液。频繁换液会破坏构建起的细胞微环境。
 

OriCell^®人脐带间充质干细胞 • 完整解决方案

深耕科研干细胞17个年头，赛业OriCell®可为科研工作者提供UCMSC完整解决方案，包括原代的干细胞及标记干细胞，各类配套培养基、进口胎牛血清、冻存液等实验好物，亦可为您提供UCMSC相关干细胞技术服务。